deteksi penyakit benih dengan ELISA

DETEKSI PENYAKIT TERBAWA BENIH MENGGUNAKAN METODE DIRECT-ELISA

(ENZIME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

Oleh :

Hasan Bisri

A34120037

Asisten Praktikum :

Lina Fadliatul jannah A34110012

Ulfah Hafidzah A34110080

Dosen :

Dr.Giyanto, M.si

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Benih merupakan struktur perbanyakan yang sangat penting bagi tanaman. Hampir semua media perbanyakan tanaman didunia modern sekarang ini menggunakan benih. Sehingga permintaan benih bermutu tinggi menjadi semakin meningkat.

Benih bermutu merupakan perpaduan dari tiga aspek, yaitu mutu fisik, genetik dan fisiologis. Benih bermutu juga merupakan benih yang terbebas dari patogen terbawa benih. Sehingga perlu diketahui mekanisme cara pendeteksi dan identifikasi patogen terbawa benih (Sudrajat 2009).

Elisa digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi/antigen dengan menggunakan antibodi/antigen spesifik. Teknik elisa juga bisa digunakan untuk menguji kuantitatif pengujian kadar antibodi/antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu spektrofotometer.

Tujuan

Praktikum bertujuan untuk mempelajari teknik pengujian patogen terbawa benih menggunakan uji serologi Direct-ELISA.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat.

Bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman uji, Buffer coating (AB-1st), PBST, Buffer ekstraksi (AG), Buffer konjugat (AB-2nd), dan Buffer substrat (PNP). Sedangkan alat yang dipakai adalah Plat ELISA, pipet mikrotitter, dan ELISA reader.

Metode

Metode uji yang dipakai kali ini adalah Direct ELISA. Terdapat delapan sumuran plat ELISA yang dipakai. Dua sumuran pertama adalah buffer, dua sumuran berikutnya untuk sampel negatif, dua selanjutnya dalah sampel positif, dan dua sumuran terakhir adalah sampel uji.

Pertama, buffer coating di masukkan kedalam sumuran ELISA sebagai anti bodi pertama. Setelah itu diinkubasi selama dua jampada suhu ruang. Setelah itu sumuran dicuci dengan menggunakan PBST sebanyak 4-8 kali. Kemudia sisa cairan pada sumuran diketokkan sehingga sisa-sisa cairan hilang. Sumuran ditambahkan antigen berupa buffer ekstraksi benih atau tanaman yang diuji. Setelah itu diinkubasikan kembali dan dicuci seperti halnya cara yang pertama. Setelah itu sumuran ditambahkan buffer konjugat sebagai anti bodi kedua. Setelah itu inkubasi dan cuci kembali seperti cara yang pertama. Terakhir sumuran ditambahkan buffer substrat beerupa PNP kemudian diinkubasikan kembali. Setelah semuanya selesai plat ELISA di baca menggunakan ELISA reader.

PEMBAHASAN

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1972 oleh Engval dan Perlman . Teknik ini dapat digunakan untuk mendeteksi zat antibodi atau antigen. Prinsip dari uji ELISA adalah reaksi kompleks antigen-antibodi dengan melibatkan peran enzim kojugasi anti spesien imunoglobulin dan substrat sebagai indikator dalam reaksi .

Teknik ini merupakan uji serologik kwantitatif dan dilakukan dengan menggunakan pelat mikrotiter. Untuk mendeteksi kadar antibodi terhadap Mg pada serum darah ayam, pengerjaan uji Elisa dilakukan sebagai berikut.

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan skunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai sinyal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.

Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagai macam jenis teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan antara lain adalah

1.ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel. ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Secara prosedur, microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang lubang microtiter sehingga antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain: immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim, tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi, amplifikasi signal rendah, larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

Kelebihan dari ELISA direct antara lain: metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi, kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

2.ELISA Indirect.

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Pada ELISA indirect, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain: membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal.

Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain: terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara komersial di pasar, immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda, tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder.

Teknologi modern membuat uji ini semakin berkembang. Akhirnya dikembangkan tekni uji ELISA berikutnya. Diantaranya adalah ELISA Sandwich dan ELISA Biotinstreptavidin, ELISA Kompetitif, dan ELISA Multipleks. Metode-metode ini merupakan pengembangan dua metode sebelumnya. Secara prinsip hampir sama yaitu pengenalan antigen dan anti bodi (Layla et al 2010).

Berbagai metode ELISA dapat membantu jalannya proses deteksi patogen terbawa benih. Prinsip identifikasi protein spesifik patogen (antigen) menggunakan antibodi yang sesuai pula dapat memberikan simpulan yang akurat terhadap deteksi dan identifikasi patogen terbawa benih.

SIMPULAN

Deteksi penyakit terbawa benih dapat dilakukan dengan metode uji serologi antigen dan antibodi. Salah satu jenis metodenya adalah metode ELISA. Terdapat beberapa jenis metode ELISA. Dengan adanya metode ini antigen yang merupakan protein spesifik dari patogen akan terdeteksi sehingga para penguji dapat mengidentifikasi patogen terbawa benih secara akurat.

DAFTAR PUSTAKA

Layla Z, Purwadikata MB.2010.teknik uji aglitunai cepat dan Enzime-Linked immunosorbent Assay (ELISA)untuk mendeteksi anti bodi Mycoplasma galliseptum[internet]. Tersedia pada :http;/balitnak.pertanian.go.id. diunduh pada : 27 April 2015.

Miftakhurohmah, Suastika Gede, damayanti TA.2013.Deteksi secara serologi dan molekular beberapa jenis virus yang berasosiasi dengan penyakit mosaik tanaman nilam (Pogostemon cablin Benth).Jurnal Littri.19(3). Hlm :130-138.

Sudrajat DJ, Nurhasybi.2009.Pengembangan metode pengujian dan standar mutu benih dan bibit tanaman hutan.Bogor (ID):Balai Penelitian Teknologi Perbenihan Bogor.